Durante la celebración de un gran baile en el palacio Casa del Prínxipe, la archiduquesa, Juana sintió los primeros dolores de parto. A las pocas horas, las tres de la madrugada del día 24 de febrero del año 1500, la hija de los Reyes Católicos, dio a luz al segundo de sus hijos, el que habría de ser heredero de las coronas de Castilla y Aragón, de las Casas de Austria y Borgoña y del Sacro Imperio Roman Germánico.